過去十年見證了干細胞基礎生物學和臨床轉(zhuǎn)化研究的飛速發(fā)展。干細胞分離、分化和純化，干細胞特性、 功能維持和穩(wěn)定擴增技術方案不斷完善，臨床試驗大量涌現(xiàn)。探索干細胞在整形修復美容領域的系統(tǒng)化、科 學化、規(guī)范化和標準化，以及安全有效應用路徑的共識，已具備扎實的科學理論和實踐基礎。本共識邀請國內(nèi)外干細胞基礎研究的一線專家和整形修復美容外科領域干細胞研究的前沿臨床研究專家共同撰寫，達成的每項陳述和推薦均至少有3位相關領域的專家總結(jié)。由于目前干細胞領域研究紛繁而復雜，本共識不可能解決所有的疑惑，旨在溝通和提高我國整形修復美容領域從事干細胞基礎和臨床研究工作者的認知，以期更好地推動干細胞的臨床轉(zhuǎn)化應用研究。希望本共識的發(fā)表，能夠激發(fā)該領域未來的高質(zhì)量研究去逐步探索和解決在本共識中未解決的相關問題。
1 總則
本共識所指干細胞是一類同時具備自我更新能力和分化潛能的細胞；可以來自胚胎組織，也可以來自成體組織；自體或者異體，體外分離、純化濃縮、培養(yǎng)、傳代或者是不培養(yǎng)、不傳代，新鮮或者凍存。
1.1開展干細胞臨床前研究和臨床研究的要求
2015 年，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會（現(xiàn)國家衛(wèi)生健康委員會）和國家食品藥品監(jiān)督管理總局（現(xiàn)國家 藥品監(jiān)督管理局）連續(xù)發(fā)布《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》[1]、《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導 原則（試行）》[2]和《關于開展干細胞臨床研究機構(gòu)備案工作的通知》[3]三項政策，標志著干細胞轉(zhuǎn)化臨床研究 的相關政策落地。干細胞臨床前研究和臨床研究要在遵循這三項政策的原則指導下進行。
1.1.1 干細胞臨床前研究要求
必須嚴謹設計研究計劃、記錄報告必須翔實可追溯、確保試驗符合科學和醫(yī) 學的要求，為干細胞臨床試驗研究提供必須具備的充分科學依據(jù)。所用細胞要求與臨床細胞一致。細胞產(chǎn)品 的生產(chǎn)和加工必須在滿足藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacture practices, GMP）的環(huán)境下進行；此外，還 需要對細胞群，細胞基因組穩(wěn)定性、成 / 致 / 促瘤性、異常分化及生物學功能和效應進行分析鑒定。動物模型 的選擇遵循減少（reduce）、優(yōu)化（refine）和代替（replace）三個原則。有效性研究設計原則要求：模擬臨床試驗 條件，足夠的統(tǒng)計功效，合適足夠的對照、隨機法、盲法，建立劑量效應關系等。安全性研究包括：細胞生物分 布、異位異常分布與分化及對其他長短期的可能毒副作用的監(jiān)測。
1.1.2 干細胞臨床研究的要求 干細胞臨床研究機構(gòu)需符合國家要求；干細胞臨床研究項目應當在已完成 備案的機構(gòu)實施；干細胞臨床研究必須具備充分的科學依據(jù)，應權(quán)衡受試者和公眾健康預期的受益及風險， 預期的受益應超過可能出現(xiàn)的損害。臨床研究方案應當符合新版《藥物臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》[4]的要求，干 細胞制劑符合《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）》[2]的要求，同時通過機構(gòu)的倫理審查和 學術審查并提交國家衛(wèi) 生健康委員會和國家藥品監(jiān)督管理局備案。研究結(jié)束后，應當對受試者進行長期隨訪監(jiān)測，評價干細胞臨床研究的長期安全性和有效性。
1.2 干細胞及其相關產(chǎn)品制備機構(gòu)的要求
⑴干細胞及其相關產(chǎn)品制備機構(gòu)（以下簡稱機構(gòu)）建設應有符合標準的 GMP 生產(chǎn)車間：整體萬級，局部 百級；符合 YY0033 第三類醫(yī)療器械生產(chǎn)標準；布局符合藥品 GMP 要求；每臺儀器的使用都有相應的標準操 作流程（standard operation procedure, SOP）。
⑵機構(gòu)應建立符合 GMP 要求、完整的干細胞制劑制備質(zhì)量管理 體系，并設立獨立的質(zhì)量管理部門，履行質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的職責。機構(gòu)應根據(jù)每種干細胞制劑的特性及 其制備工藝進行風險評估。
⑶機構(gòu)應建立合理的質(zhì)量管理策略，指定具體的干細胞制劑制備管理負責人、質(zhì) 量管理負責人和質(zhì)量授權(quán)人。同時建立人員、設備管理檔案，并對相關人員完成專業(yè)知識、安全防護、應急預 案的培訓和繼續(xù)教育，對設備進行計劃性校驗和維護，確保制劑生產(chǎn)的準確性。
2 在整形修復美容領域應用研究常見的干細胞類型
2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）是從骨髓組織中分離獲取的一類間充 質(zhì)干細胞，F(xiàn)riedenstein 等[5]于 1976 年首次報道。BMMSCs 可貼壁生長，具有向中胚層組織細胞分化的能力。幾 乎所有的造血細胞表面標志物（CD34、CD14、CD45 等）在 BMMSCs 中呈陰性表達[6- 7]，BMMSCs 表面表達的標 記物包括整合素（CD49、CD29、LFA- 3），免疫球蛋白超家族（CD54、CD102），血管細胞黏附分子（CD106、 CD44、CD166）等[8- 10]。BMMSCs 主要來源于骨髓液，可通過髂前上棘穿刺抽取，也可自脛骨、股骨、胸骨等骨中 獲取。抽取的骨髓液通過密度梯度離心法、全骨髓培養(yǎng)貼壁篩選法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠法等可篩選 出大小均勻、純度相對較高的 BMMSCs[11]。BMMSCs 的擴增速度極快，短時間的培養(yǎng)后即可獲取大量的細胞。
2.2 脂肪來源干細胞 1973 年，Poznanski 等在脂肪中發(fā)現(xiàn)了類似于成纖維樣的細胞，在體外也能保持代謝活性[12]；2001 年， Zuk 等證實這些細胞中存在間充質(zhì)干細胞并命名為脂肪來源干細胞（adipose- derived stem cells，ADSCs）[13]。其表達基質(zhì)細胞相關標志物（CD29、CD44）、間充質(zhì)細胞標志物（CD73、CD90），基本不表達造血源性細胞標 志物 CD45 及 MHCⅡ相關蛋白 HLA- DR[13- 14]。從脂肪組織中分離 ADSCs 的主要方法是膠原酶消化法，操作 簡單，產(chǎn)量較高；此外還有組織塊貼壁法、吸附柱法、直接離心法、機械振蕩法等，但效率較低[15- 17]。在用膠原 酶處理脂肪組織后，收集的底層細胞團被稱為脂肪血管基質(zhì)片段（stromal vascular fraction，SVF），是一類包括 ADSCs、脂肪前體細胞（脂肪祖細胞）、周細胞、內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮祖細胞、單核 / 巨噬細胞和造血干細胞等在內(nèi) 的異質(zhì)性細胞群，也具有促進組織再生的功能[18- 19]。
2.3 臍帶間充質(zhì)干細胞 臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）是一種自臍帶分離的間充質(zhì)干細胞， 最早在 21 世紀初被報道[20]。臍靜脈內(nèi)皮、臍帶 Wharton's 膠質(zhì)和血管周圍組織中均可分離獲得 UCMSCs[21- 23]。UCMSCs 具有典型的間充質(zhì)干細胞表面標志物表達特點，CD29、CD44、CD105、CD166、OCT- 4 和 c- myc 均呈 陽性表達,CD34 和 CD14 均呈陰性表達[24]。UCMSCs 具有長期自我更新、高擴增性和表型穩(wěn)定性[25]。目前尚無 公認的分離 UCMSCs 方法，使用較多的方法有組織塊貼壁法和酶消化法。UCMSCs 的來源是醫(yī)療廢棄物臍 帶，倫理上較易獲得知情同意授權(quán)回收利用，受到臨床轉(zhuǎn)化應用的青睞[26]。
2.4 毛囊間充質(zhì)干細胞 毛囊間充質(zhì)干細胞（hair follicle mesenchyma stem cell, HFMSCs）分布在兩個部位：毛囊球部的真皮乳 頭（dermal papilla, DP）和毛囊球部最外層的真皮鞘（dermal papilla, DS）內(nèi)[1- 2]。通過周期性地在 DP 和 DS 間遷 移，實現(xiàn)隨毛發(fā)周期的 DP 和 DS 功能性重組[3- 4]。相比于來源于骨髓、脂肪、臍帶等組織的間充質(zhì)干細胞， HFMSCs 具有來源豐富、取材簡單、對機體創(chuàng)傷小且無年齡限制等優(yōu)點。HFMSCs 也具有成骨、成脂和成軟骨 潛能，表面陽性標記物有 CD44、CD73、CD90、CD105[5- 7]。HFMSCs 的分離是用中性蛋白酶 + 膠原酶消化皮脂 腺下 2 mm 以下的毛囊下端，擴增培養(yǎng)后通過表面標志物分選出 HFMSCs[8- 9]。由于 HFMSCs 在體外培養(yǎng)過程 中其誘導能力逐漸喪失，所以目前關于維持 HFMSCs 干細胞特性的方法主要是 3D 培養(yǎng)，包括懸滴法、ECM 法、LBL 法等[9- 12]。
2.5 牙髓間充質(zhì)干細胞 牙髓間充質(zhì)干細胞（human dental pulp stem cells, hDPSCs）作為人體牙髓組織中存在的一種間充質(zhì)干細胞，與其他間充質(zhì)干細胞一樣具有很強的增殖力、自我更新和多向分化能力,同時還具有免疫調(diào)節(jié)功能和潛 在的組織再生特性[27- 28]。hDPSCs 與 BMMSCs 具有相似的免疫表型，同樣表達 CD73、CD90 和 CD105，不表達 CD14、CD34 和 CD45 等表面標記，但 hDPSCs 具有更高的增殖率和克隆形成能力[27]。迄今為止，已分離和鑒 定出 8 種不同的 hDPSCs，其中應用最為廣泛的是 hDFSCs，其分離培養(yǎng)的方法與其他組織間充質(zhì)干細胞方法 類似[29]。
2.6 胚胎干細胞、誘導性多功能干細胞等其他干細胞 胚胎干細胞（embryonic stem cells, ESCs）是一種從早期胚胎或內(nèi)細胞團中分離出來的全能干細胞，可以 向 3 個胚層分化，在體內(nèi)或體外環(huán)境均可被誘導分化為機體幾乎所有細胞類型[30]。ESCs 表達的特異性標志 物包括 SSEA- 3、SSEA- 4、TRA- 1- 60、TRA- 1- 81、TRA- 2- 49/6E 和 Nanog[31]。然而胚胎干細胞的使用仍存在風 險和倫理問題。誘導性多功能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是利用哺乳動物的成體細胞，由人 工轉(zhuǎn)入 Oct4、Sox2、c- Myc、Klf4 四種轉(zhuǎn)錄因子，使成體細胞執(zhí)行去分化途徑而形成類似于胚胎干細胞的多能 干細胞[32]。iPSCs 與 ESCs 擁有相似的再生能力，理論上可以分化為所有成體器官、組織，其表面標志物與未分 化的 ESCs 類似。相比 ESCs，iPSCs 面臨的倫理道德爭議較小，但 iPSCs 誘導技術面臨著誘導效率低，用于治 療存在長期腫瘤風險等挑戰(zhàn)[33- 34]。其他的干細胞還包括胎盤、羊水以及尿液等來源間充質(zhì)干細胞，這些細胞 也具有多向分化能力和較高的增殖能力。
3 干細胞保存的規(guī)范
高質(zhì)量穩(wěn)定保存干細胞資源是干細胞應用中的關鍵環(huán)節(jié)，低溫冷凍保存技術為干細胞的運輸、長期存 儲、活性和功能的保存提供了至關重要的保證。研究表明組織和細胞雖然可以在 - 196 ℃低溫下長期保存， 但卻易在降溫和復溫過程中受溶液凍結(jié)、融化以及溶液滲透壓變化等因素的作用而發(fā)生損傷[35]。冷凍損傷通 常原因是在 - 60~0 ℃細胞內(nèi)冰晶形成，在對細胞造成直接損傷的同時導致細胞內(nèi)外酸堿度、滲透壓等發(fā)生改變。通過加入冷凍保護劑和程序性降溫，可減少細胞內(nèi)冰晶形成，提高細胞活性。冷凍保護劑根據(jù)其是否穿 透細胞膜通常分為兩大類型，即滲透性冷凍保護劑和非滲透性冷凍保護劑[35]。滲透性冷凍保護劑多為小分子 中性物質(zhì)，其作用為弱化水結(jié)晶過程，減少對細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，主要包括甘油、二甲基亞砜（DMSO）、 丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性保護劑多為大分子物質(zhì)，通過降低溶質(zhì)濃度來減少低溫凍存對細 胞的損傷，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、白蛋白等。不同種干細胞的低 溫生物特性不相同, 應對冷凍損傷的能力各有不同。因此，應用特有的最佳低溫保存方法保存不同的干細 胞才能確保復溫后的干細胞“安全 - 有效”[36- 38]。
4 整形修復美容領域干細胞的主要臨床研究方向
4.1 在增加組織血管化和抗纖維化中的應用 組織血運障礙是整形外科常處理的問題，干細胞可被用于治療皮瓣缺血及其他組織缺血性疾病。臨床 前研究已證實，干細胞有促進細胞遷移、成管的能力，可改善皮瓣血液循環(huán)，促進皮瓣成活[39- 40]。在缺血的手 部移植皮瓣內(nèi)及周圍組織中注射 SVF，可觀察到皮瓣血運有明顯改善，手功能改善[41]。干細胞在下肢缺血疾病 中也有應用，在嚴重下肢缺血的病例中，通過肌肉內(nèi)注射 CD133+ 的干細胞，可刺激新血管生成[42- 43]。在瘢痕治 療方面，BMMSCs 可用于預防肥厚性瘢痕患者移植后皮膚移植物的收縮[13]。此外，皮下局部應用 BMMSCs 可明 顯改善中、重度萎縮性痤瘡瘢痕，且無明顯副作用[14]。還有研究應用 ADSCs 治療系統(tǒng)性硬化癥的指端潰瘍， 發(fā)現(xiàn)可促進創(chuàng)面愈合，改善疼痛癥狀和手功能[44]。
4.2 在創(chuàng)傷后皮膚再生與創(chuàng)面愈合中的應用 創(chuàng)傷居疾病譜首位，其中皮膚缺損最為多發(fā)。同時，糖尿病、脈管疾病等引發(fā)的皮膚潰瘍創(chuàng)面也是高發(fā) 病[45]。近年來發(fā)現(xiàn)干細胞可通過直接分化、旁分泌生長因子等多個途徑參與皮膚再生。在外傷導致的急性皮 膚全層缺損中，局部注射 ADSCs 可縮短創(chuàng)面愈合時間，減少繼發(fā)性瘢痕攣縮、色素沉著和增生的發(fā)生[46]。在糖 尿病足、慢性創(chuàng)面等多種難愈性創(chuàng)面的治療中，在創(chuàng)面邊緣及基底注射干細胞可有效促進組織血管新生、加速 肉芽組織形成、改善組織血供，同時促進創(chuàng)緣角質(zhì)形成細胞的增殖，加速創(chuàng)面再上皮化進而促進愈合[47- 48]。相較 于無毛囊的皮片，帶有毛發(fā)的皮膚移植物因含有毛囊干細胞和更多的表皮干細胞，在促進慢性潰瘍愈合中可 達到更好的效果[49]。皮膚擴張中，局部的張力可誘導血液循環(huán)中干細胞向擴張皮膚局部遷移，在局部定植后通過分化和合成生長因子促進擴張皮膚組織再生[50]。另有研究證實，干細胞在促進光老化和衰老后的皮膚再 生年輕化等方面有顯著效果[51]。
4.3 在脂肪移植后再生中的應用 脂肪移植是軟組織萎縮和缺損修復的重要方法，但移植的脂肪組織由于缺乏血供與生長因子，常出現(xiàn)較 高的吸收率及纖維化、鈣化等現(xiàn)象，影響其療效[52]。應用干細胞輔助脂肪移植（cell- assisted lipotransfer, CAL） 后脂肪細胞成活率提高，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)更好，并發(fā)癥更少[53- 55]。在乳房脂肪填充中，加入干細胞可以提高移植 后脂肪的成活率，減少脂肪注射后纖維化、囊腫等并發(fā)癥的發(fā)生率，同時未觀察到脂肪異常增殖、腫瘤等并發(fā) 癥的發(fā)生[55- 56]。另外，在半面萎縮的治療中，也觀察到應用 CAL 可提高脂肪的成活率[57]。
4.4 在毛發(fā)再生中的應用 脫發(fā)是困擾現(xiàn)代人的重要問題，除了與雄激素代謝物二氫睪酮相關的代謝障礙有關，也與毛囊周圍血管 化減少和生長因子失去平衡有關[58]。干細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子、 血小板衍生生長因子等多種細胞因子[59]，一方面可調(diào)控復雜的毛發(fā)生長周期，另一方面可促進毛囊周圍的血 管化[60]，誘導毛囊真皮乳頭增殖及調(diào)控毛囊由休止期進入生長期，促進毛發(fā)生長、毳毛發(fā)育為終毛[61- 62]。在脫 發(fā)區(qū)域皮膚內(nèi)注射 ADSCs 和 SVF，可觀察到注射區(qū)域毛發(fā)密度有所增加、毛發(fā)直徑顯著增粗[63- 64]。ADSCs 的 條件培養(yǎng)基也具有促進毛發(fā)再生的效果，多次注射后效果與非那雄胺療效接近[65]。自體 BMMSCs 及自體 HFMSCs 也被報道在治療難治性斑片狀脫發(fā)和雄激素性脫發(fā)中有顯著作用[66]。
4.5 在骨與軟骨再生中的應用 目前針對因創(chuàng)傷、腫瘤、先天畸形等導致的骨和軟骨缺損的修復，臨床上主要采用的是自體組織移植、異 體組織移植和替代物植入等方法，但應用范圍和治療效果有一定的局限性[67- 69]。BMMSCs 和 ADSCs 是在骨和 軟骨缺損臨床研究應用中最常見的干細胞類型，向骨、軟骨的局部缺損注射 BMMSCs 或 ADSCs 可促進組織 修復再生[70- 72]。將干細胞與生物支架材料復合，不僅可提高干細胞利用效率，而且支架材料的引入也為干細 胞再生提供更有利的微環(huán)境，使其具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更優(yōu)化的功能[73]。關節(jié)腔內(nèi)注射 ADSCs、BMMSCs 或 hDPSCs，可以通過調(diào)節(jié)局部炎癥、促進軟骨再生修復從而緩解疼痛、控制關節(jié)炎的發(fā)展[74]。臨床研究顯示采用 自體干細胞治療骨缺損是安全有效的，尚無研究顯示發(fā)生炎癥、感染、組織過度生長或腫瘤發(fā)生等[75]。
5 干細胞衍生物的應用研究
干細胞附屬產(chǎn)品包括干細胞條件培養(yǎng)液（conditioned medium, CM）、促進組織再生的生長因子（growth factor, GF）、分離自血液的富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）等[76- 78]。此類產(chǎn)品主要地有效成分是干細胞 分泌的生長因子，使用方法包括凝膠狀制劑涂抹創(chuàng)面、局部組織內(nèi)注射填充以及液體產(chǎn)品在局部組織內(nèi)的注 射。通過在老化的皮膚中補充生長因子，可提高皮膚通過各種活性因子促進真皮層內(nèi)纖維母細胞的增殖能力， 修復老化的膠原纖維與彈性纖維，還原肌膚彈性并減少皺紋。在脫發(fā)治療中局部注射此類產(chǎn)品可促進毛囊 的活化和再生。PRP 類產(chǎn)品一般可在臨床機構(gòu)直接采集獲??；CM和 GF 類產(chǎn)品則需要由符合 GMP 標準的專 業(yè)干細胞制劑生產(chǎn)機構(gòu)或制藥機構(gòu)進行制備。干細胞的另一類重要的衍生產(chǎn)品外泌體（exosome）近年來得到 了廣泛關注。外泌體是機體內(nèi)細胞通過胞吞作用形成多泡小體后，通過細胞膜融合分泌到細胞外環(huán)境中的微 小囊泡，直徑為 30~100 nm[79]；其內(nèi)含有功能性蛋白質(zhì)、mRNA 及 microRNA 等物質(zhì)，在細胞間的信息傳遞過程 中發(fā)揮重要作用[80]。外泌體可從多種體液和細胞培養(yǎng)上清液中分離，最廣泛使用的分離方法是高速離心與超濾 法。近年來發(fā)現(xiàn) ADSCs- exo具有與 ADSCs 近似生物活性的生長因子、趨化因子、脂質(zhì)等多種活性物質(zhì)[81- 82]，可 促進血管內(nèi)皮的增生。應用血小板衍生的生長因子可促進 ADSCs 釋放增強血管生長潛力的外泌體[83]。在骨缺 損模型研究中發(fā)現(xiàn)，將外泌體加載于生物支架上，有促進細胞遷移與歸巢，誘導骨再生的作用[84]。干細胞衍生物相較干細胞產(chǎn)品具有如下優(yōu)勢：屬于無細胞生物治療，倫理上容易接受；同時性質(zhì)更穩(wěn)定， 易于保存，便于管理及運輸；生物學功能不隨時間延長而衰減；低抗原性，同種異體應用不會引起免疫反應， 可能會比干細胞臨床轉(zhuǎn)化更快地走向臨床。
6 總結(jié)與展望
干細胞作為體內(nèi)一種具有多向分化能力和分泌能力的細胞，具有增殖能力強、免疫力低的特點。干細胞 及其衍生物的治療是具有重要臨床應用前景的再生醫(yī)學手段。在整形修復美容外科領域經(jīng)過了多年的基礎與臨床研究證明其在促進皮膚再生與修復、組織血管化、軟組織再生、骨與軟骨修復、多組織年輕化及毛囊再 生等多方面均有較好的治療效果。但是仍需看到干細胞應用中存在的致突變、致瘤等問題并未完全解決，尤 其是治療的標準化問題未解決，說明干細胞在治療疾病中的作用機制、應用方法、安全性和有效性等基礎和 臨床研究均需進一步完善。
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